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2020, 37(8):804-807.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.20046

甲維鹽和高效氯氰菊酯混配染毒對雄性小鼠睪丸生化指標及精子質量的影響


1. 濰坊醫學院婦幼保健院新生兒科, 山東 濰坊 261011 ;
2. 濰坊醫學院公共衛生學院, 山東 濰坊 261053 ;
3. 濰坊市疾病預防控制中心, 山東 濰坊 261061

收稿日期: 2020-02-10;  錄用日期:2020-05-29;  發布日期: 2020-09-07

基金項目: 山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2016WS0670);山東省高等學??萍加媱濏椖浚↗18KB120)

通信作者: 李媛媛, Email: [email protected]  

作者簡介: 李媛媛(1981—),女,碩士,主治醫師;E-mail:[email protected]

利益沖突??無申報

[背景] 使用混配農藥進行殺蟲在農業生產中已成為普遍現象,由此造成的食物農藥殘留問題較為突出,嚴重威脅人體健康。甲維鹽(一種大環內酯類天然殺蟲劑)和高效氯氰菊酯(一類典型的擬除蟲菊酯類殺蟲劑)混配殺蟲是溫室種植者較為常用的混配方式。

[目的] 探討甲維鹽和高效氯氰菊酯混配染毒對小鼠睪丸生化指標及精子質量的影響。

[方法] 選擇40只健康10周齡清潔級雄性昆明小鼠作為實驗動物,隨機分為4組,每組10只:正常對照組(花生油)、甲維鹽組(1/20 LD50=5.465 mg·kg-1)、高效氯氰菊酯組(1/20 LD50=4.65 mg·kg-1)、混配組(5.465 mg·kg-1甲維鹽+4.65 mg·kg-1高效氯氰菊酯)。采用灌胃方法進行染毒,每日染毒1次,灌胃量為每10 g體重0.1 mL,每周染毒6 d,共計5周,累積染毒30 d。染毒結束后第2天處死動物,檢測小鼠睪丸組織中丙二醛(MDA)含量以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)活性,并檢測精子計數和精子畸形率。

[結果] 各實驗組未觀察到小鼠精神、活動、飲食量及體態的明顯差異。各組小鼠睪丸組織中GSH-PX、T-SOD、LDH酶活性差異具有統計學意義(P < 0.05),并且混配組GSH-PX活性[(117.20±51.76)U·mg-1,以蛋白計,余同]高于甲維鹽組[(71.37±11.16)U·mg-1](q=4.08,P < 0.05)、高效氯氰菊酯組[(76.84±36.29)U·mg-1](q=3.59,P < 0.05)。各組小鼠精子計數和精子畸形率差異具有統計學意義(P < 0.05),并且混配組精子畸形率[(28.50±1.85)%]高于甲維鹽組[(20.20±4.21)%](q=6.91,P < 0.01)、高效氯氰菊酯組[(23.75±2.99)%](q=3.96,P < 0.05)。析因分析發現,甲維鹽和高效氯氰菊酯染毒對小鼠睪丸組織中GSH-PX酶活性的交互作用存在統計學意義(P < 0.05),高效氯氰菊酯染毒對睪丸組織中T-SOD活性、LDH活性、精子畸形率和精子計數的主效應有統計學意義(P < 0.05)。

[結論] 農藥甲維鹽及高效氯氰菊酯染毒均可降低小鼠精子質量,但未發現甲維鹽和高效氯氰菊酯混配染毒對小鼠精子畸形率和精子計數存在交互作用。

關鍵詞: 高效氯氰菊酯;  甲維鹽;  精子質量;  氧化損傷;  生殖健康 

使用混配農藥進行殺蟲在農業生產中已成為普遍現象,由此造成的食物農藥殘留問題嚴重威脅人體健康。農藥會影響生殖內分泌系統的功能,干擾機體內正常的激素合成、分泌、轉運、結合、代謝及調節等過程,導致精子異常以及破壞DNA完整性等,還會通過作用于睪丸引起精子發生障礙,通過作用于附睪引起精子成熟障礙等[1]。本課題組前期調查發現,在溫室蔬菜生產活動中,農藥混配使用現象嚴重,經常配伍使用的農藥有阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(簡稱甲維鹽)、啶蟲脒以及氯氰菊酯等[2],其中以甲維鹽和高效氯氰菊酯混配較為常用。甲維鹽是一種大環內酯類天然殺蟲劑,具有廣譜、高效、低毒、低殘留等優點,高效氯氰菊酯是一類典型的擬除蟲菊酯類殺蟲劑,殺蟲活性比氯氰菊酯高一倍,是一種更為高效、廣譜、速效的Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑。目前有關高效氯氰菊酯生殖毒性的研究較多,而關于甲維鹽生殖毒性的研究主要集中于對害蟲、昆蟲繁殖和發育的影響,目前尚未發現其對哺乳動物生殖健康影響的相關報道,亦未查見針對兩者聯合毒作用的研究報道。本研究擬探討甲維鹽和高效氯氰菊酯致小鼠睪丸氧化損傷及對精子質量的影響,為今后相關流行病學研究及農藥危害評價提供研究基礎。

1   對象與方法

1.1   動物分組及染毒方法

選擇40只10周齡清潔級健康雄性昆明小鼠作為實驗動物,體重15~20 g,由濰坊醫學院動物中心提供[動物合格證號:SCXK(魯)20050015]。染毒前用該動物中心配制的標準飼料喂飼,動物房室溫18~22℃,相對濕度45%~60%。將小鼠隨機分為4組,每組10只:正常對照組(花生油)、甲維鹽組(1/20 LD50= 5.465mg·kg-1)、高效氯氰菊酯組(1/20 LD50=4.65mg·kg-1)、混配組(5.465 mg·kg-1甲維鹽+4.65 mg·kg-1高效氯氰菊酯)。采用花生油稀釋配制等體積不同濃度染毒試劑,采用灌胃方法進行染毒,每天1次,灌胃量為每10 g體重0.1 mL,每周染毒6 d,共計5周,累積染毒30 d。在染毒第2周時混配組有3只小鼠出現非正常死亡,未發現有中毒的臨床表現,故未納入分析。非正常死亡原因可能與動物飼養系統中這3只小鼠的籠具未正確放置有關。本研究主要參考了本課題組前期預實驗結果,選定了1/20 LD50作為混配染毒劑量;染毒天數則主要考慮了晚期精原細胞和早期初級精母細胞的生殖細胞對大部分化學致突變物較為敏感,故選擇首次給藥后的第35天處死小鼠。本研究遵循了濰坊醫學院和國家有關實驗動物管理和使用的規定。

1.2   試劑與儀器

丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)試劑盒、酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(南京建成,中國),IVC動物飼養系統(Tecniplast,意大利),FYL-YS-150L恒溫水浴箱(北京福意,中國),Multiskan FC酶標儀、SORVALL低溫冷凍離心機(Thermo,美國)。

1.3   小鼠睪丸組織中T-SOD、GSH-PX、MDA、LDH和ACP的測定

末次染毒結束后第2天處死小鼠,迅速剝離睪丸后稱重,加入冰生理鹽水研磨制成質量分數為10%的睪丸組織勻漿,然后在低溫條件下離心10 min(2 000 r·min-1,離心半徑10 cm),取上清液,使用相應試劑盒測定睪丸組織中GSH-PX、T-SOD、LDH、ACP酶活性和MDA含量。

1.4   小鼠精子質量檢測

1.4.1   精子計數檢測

染毒結束后取小鼠一側附睪尾,置于1 mL預溫36℃的生理鹽水中剪碎并吹打混勻,于35℃的溫箱中孵育5~10 min,然后用四層擦鏡紙過濾,制成精子懸液。2名研究人員分別用吸管吸取1滴懸液滴于血細胞計數板上,用顯微鏡計數,計算出每毫升單側附睪精子懸液中的精子數量平均值。

1.4.2   精子畸形率檢查

取1滴精子懸液滴在潔凈玻璃片的一側,推片、自然晾干、甲醇固定5 min、干燥、2%伊紅染色2 h、背面沖洗、晾干。采用高倍鏡檢查500個完整的精子,記錄畸形精子數量并計算精子畸形率?;蔚木影^部的異常(巨大頭、無定形、雙頭、無頭等)、尾部的異常(卷曲、分叉、雙尾、無尾等)和體部的異常(過短、折裂、缺少等)。

1.5   統計學分析

采用SPSS 17.0進行統計分析,計量資料均以x±s表示。多組間的比較采用單因素方差分析,如方差不齊,則進行秩和檢驗。組間兩兩比較若方差齊采用SNK檢驗,若方差不齊采用Games-Howell檢驗。采用2×2析因分析探討甲維鹽和高效氯氰菊酯的交互作用。檢驗水準α=0.05。

2   結果

2.1   甲維鹽和高效氯氰菊酯對小鼠睪丸生化指標的影響

各實驗組間染毒前后未觀察到小鼠精神、活動、飲食量及體態的明顯差異。由表 1可見,各組睪丸組織中GSH-PX、T-SOD、LDH酶活性差異具有統計學意義(GSH-PX:F=44.42,P=0.024;T-SOD:F=3.33,P=0.031;LDH:F=3.45,P=0.027)。其中混配組GSH-PX活性高于甲維鹽組(q=4.08,P < 0.05)、高效氯氰菊酯組(q=3.59,P < 0.05)。析因分析結果顯示,甲維鹽和高效氯氰菊酯染毒對小鼠睪丸組織中GSH-PX的交互作用存在統計學意義(F=10.07,P=0.019),對其他指標的交互作用不存在統計學意義。在無甲維鹽染毒情況下,高效氯氰菊酯染毒致GSH-PX活性降低141.22 U·mg-1(以蛋白計,后同),存在甲維鹽染毒情況下,高效氯氰菊酯染毒致GSH-PX活性升高45.83U·mg-1;在無高效氯氰菊酯染毒情況下,甲維鹽致GSH-PX活性降低146.69 U·mg-1,存在高效氯氰菊酯染毒情況下,甲維鹽致GSH-PX活性升高40.36 U·mg-1。高效氯氰菊酯染毒對T-SOD(F=8.45,P=0.016)、LDH(F=3.92,P=0.028)活性的主效應具有統計學意義。

表1

甲維鹽和高效氯氰菊酯對小鼠睪丸組織中生化指標的影響(x±s

Table1.

Effects of emamectin benzoate and beta-cypermethrin on biochemical indices of testis in mice (x±s)

2.2   甲維鹽和高效氯氰菊酯對小鼠精子質量的影響

表 2所示,方差分析發現,各組精子計數(F=9.14,P < 0.001)和精子畸形率(F=21.46,P < 0.001)差異具有統計學意義。其中混配組精子畸形率高于甲維鹽組(q =6.91,P < 0.01)、高效氯氰菊酯組(q =3.96,P < 0.05)。析因分析結果顯示,甲維鹽和高效氯氰菊酯混配染毒對小鼠精子畸形率(F=0.93,P =0.652)和精子計數(F=1.68,P =0.414)的交互作用均無統計學意義,高效氯氰菊酯染毒對精子畸形率(F=8.62,P =0.008)和精子計數(F=3.23,P =0.036)的主效應有統計學意義。

表2

甲維鹽和高效氯氰菊酯對小鼠精子質量的影響(x±s

Table2.

Effects of emamectin benzoate and beta-cypermethrin on sperm quality in mice (x±s)

3   討論

本研究通過動物實驗分析了甲維鹽和高效氯氰菊酯對小鼠睪丸組織生化指標和精子質量的影響。

氧化應激已被認為是男性生殖功能障礙的主要致病因素。本研究發現,各組睪丸組織中GSH-PX、T-SOD活性差異皆具有統計學意義,混配組GSH-PX活性高于甲維鹽組和高效氯氰菊酯組,且甲維鹽和高效氯氰菊酯染毒對小鼠睪丸組織中GSH-PX活性的影響存在交互作用。國內外研究[3-6]亦發現甲維鹽、高效氯氰菊酯可提高組織或細胞中的活性氧水平,抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性增加,表明其具有誘導脂質過氧化損傷及細胞毒作用。同時,本研究發現高效氯氰菊酯染毒對T-SOD活性的主效應具有統計學意義;與對照組相比,混配組T-SOD活性降低有統計學意義,高效氯氰菊酯組雖有降低趨勢,但未發現有統計學意義,造成這種結果的原因可能是析因方差分析與組間兩兩比較的SNK檢驗這兩種統計方法檢驗效能存在差異。

睪丸標志酶LDH與生殖細胞、睪丸和精子的成熟以及精子的能量代謝有關;ACP主要與生精上皮的變性以及支持細胞的吞噬作用有關,主要功能是清除受損傷或衰老的細胞,維持正常代謝和生理功能[7]。本研究未發現甲維鹽和高效氯氰菊酯染毒對小鼠睪丸組織中LDH和ACP活性存在交互作用,各組小鼠睪丸組織中LDH活性差異有統計學意義,高效氯氰菊酯染毒及混配染毒后LDH活性均高于對照組,各組ACP活性的差異不存在統計學意義。同本研究結果相似的是,李祥婷等[7]研究發現,與對照組相比,氯氰菊酯染毒組(80mg·kg-1)睪丸勻漿中LDH、ACP活性明顯增高。

精子質量的變化可反映早期的生殖損害情況,精子數量、精子活力及精子畸形率是衡量生育能力和評估精子質量優劣的重要指標[8]。本研究發現,與對照組相比,各染毒組精子數量降低、精子畸形率增高,并且混配組精子畸形率高于甲維鹽組、高效氯氰菊酯組。由此可以認為甲維鹽和高效氯氰菊酯會影響小鼠睪丸的正常生精過程,增加小鼠的精子畸形率。Wang等[4]研究發現,高效氯氰菊酯可降低精子數、精子活力和頂體完整率,并且中、高劑量(10、20 mg·kg-1)高效氯氰菊酯增加了睪丸MDA和一氧化氮水平,降低了過氧化氫酶、GSH-PX和SOD活性,由此推定其生殖毒性作用主要通過氧化應激來介導。國內外亦有研究[6, 9]發現,高效氯氰菊酯暴露可降低睪丸精子頭數、精子活力和活精子數,增加精子畸形率等。然而本研究析因分析未發現甲維鹽和高效氯氰菊酯混配染毒對小鼠精子畸形率和精子計數存在交互作用,這可能與甲維鹽和高效氯氰菊酯的毒作用機理存在差異有關。

綜上所述,本研究證實甲維鹽和高效氯氰菊酯均可降低小鼠精子質量,可能是由于其誘發小鼠發生氧化-抗氧化系統異常、導致生精障礙引起。本研究未發現甲維鹽和高效氯氰菊酯混配染毒對小鼠精子畸形率和精子計數存在交互作用。由于實驗總體設計受限,本研究主要檢測了睪丸組織中MDA及抗氧化指標GSH-PX、T-SOD等表型指標,未針對其主要的作用機制如活性氧、8-羥基脫氧鳥甘等進行研究,后期將深入探討氧化應激在精子質量異常中的作用。

表1

甲維鹽和高效氯氰菊酯對小鼠睪丸組織中生化指標的影響(x±s

Table 1

Effects of emamectin benzoate and beta-cypermethrin on biochemical indices of testis in mice (x±s)

表2

甲維鹽和高效氯氰菊酯對小鼠精子質量的影響(x±s

Table 2

Effects of emamectin benzoate and beta-cypermethrin on sperm quality in mice (x±s)

參考文獻

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[基金項目] 山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2016WS0670);山東省高等學??萍加媱濏椖浚↗18KB120)

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[收稿日期] 2020-02-10

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