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2020, 37(8):808-811.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2020.20083

奧克托今及其主要合成中間體對中國倉鼠肺細胞凋亡和氧化應激的影響


兵器工業衛生研究所毒理技術研究室, 陜西 西安 710065

收稿日期: 2020-03-02;  錄用日期:2020-07-07;  發布日期: 2020-09-07

通信作者: 高俊宏, Email: [email protected]  

作者簡介: 郭旺旺(1994—),男,學士,助理工程師; E-mail:[email protected]

利益沖突??無申報

[背景] 奧克托今(HMX)是當今綜合性能最好的單質炸藥。有研究發現HMX可影響職業暴露者神經行為功能和周圍神經傳導速度。3,7-二硝基-1,3,5,7-四氮雜雙環[3,3,1]壬烷(DPT)是合成HMX的主要中間體,但目前國內外關于DPT的毒性研究尚未見報道。

[目的] 探討HMX及DPT對中國倉鼠肺細胞(CHL)細胞凋亡及氧化應激水平的影響。

[方法] 應用含有0、31.25、62.50、125、250、500 mg·L-1質量濃度(后稱濃度)的HMX、DPT分別對體外培養的CHL染毒24 h,利用CCK-8法檢測細胞活力;Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況;DCFH-DA熒光探針檢測細胞內活性氧(ROS)熒光強度。采用抗氧化劑干預,即2.5 mmol·L-1 N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理CHL 4 h,經120 mg·L-1 DPT染毒24 h后檢測細胞活力和凋亡情況。

[結果] 細胞活力檢測結果顯示DPT對CHL的半數抑制濃度為119.55 mg·L-1。當DPT濃度為250 mg·L-1時,細胞活力下降至(17.95±2.18)%;HMX濃度為500 mg·L-1時,細胞活力為(83.34±3.03)%。細胞凋亡結果顯示,與各自對照組相比,各染毒組的凋亡率均隨染毒劑量增加而逐漸升高(P < 0.05)。62.50~500 mg·L-1范圍內,HMX導致的細胞凋亡率由(15.63±0.58)%緩慢升至(37.00±1.25)%,而DPT引起的細胞凋亡率從(33.75±0.57)%迅速升至(96.57±0.53)%。細胞內ROS檢測結果顯示,HMX和DPT均能引起細胞內ROS水平升高。但HMX引起細胞內ROS變化較小,250、500 mg·L-1 HMX組細胞內ROS熒光強度分別為103.96±5.59和119.61±4.42,而相同劑量DPT組的ROS熒光強度分別為238.52±7.15和451.02±13.02(P < 0.05)。另外,NAC干預可有效緩解DPT引起的細胞活力抑制和凋亡,NAC預處理+DPT組的細胞活力、凋亡率為(76.41±4.91)%、(16.85±0.12)%,而DPT組為(48.02±2.63)%、(62.67±8.49)%(P < 0.05)。

[結論] 相同劑量下DPT對CHL的毒性大于HMX,高劑量DPT引起細胞內ROS水平升高,導致細胞凋亡。

關鍵詞: 奧克托今;  3, 7-二硝基-1, 3, 5, 7-四氮雜雙環[3, 3, 1]壬烷;  職業暴露;  細胞凋亡;  活性氧 

奧克托今,即1,3,5,7-四硝基-1,3,5,7-四氮雜環辛烷(1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetraazacyclooctane,HMX),是當今綜合性能最好的單質炸藥,在國防工業和國民經濟建設中得到廣泛應用[1]。動物實驗研究表明,小鼠急性經口染毒HMX的半數致死劑量(median lethal dose,LD50)為2 710 mg·kg-1(以體重計),大鼠LD50為7 360 mg·kg-1(以體重計)[2]。小鼠急性經口染毒5 000 mg·kg-1(以體重計)HMX 8 h后,出現聽覺刺激敏感性增高,過度興奮、頻繁抽搐等神經毒性癥狀[3]。HMX的人群暴露資料顯示,HMX(13.15 mg·m-3)暴露者以神經行為改變為主,主要表現為頭疼、記憶力減退等[3],工作場所空氣中HMX時間加權平均容許濃度為2mg·m-3,短時間接觸容許濃度為4mg·m-3[4]。

3,7-二硝基-1,3,5,7-四氮雜雙環[3,3,1]壬烷[3,7-dinitro-1,3,5,7-tetraazabicyclo[3,3,1] nonane,DPT]是合成HMX的重要中間體[5-7]。在實際作業場所,HMX和DPT均以氣溶膠形式存在于粉塵中,作業人員的暴露途徑以吸入為主[8]。因此,迫切需要研究HMX和DPT的毒性及其毒作用機制,為科研、生產人員的職業防護提供依據。本課題以中國倉鼠肺細胞(Chinese hamster lung cells,CHL)為研究對象,進行不同濃度HMX和DPT染毒,探討兩種物質對CHL的毒性及其機制。

1   材料與方法

1.1   主要儀器與試劑

CO2培養箱(SHELLAB公司,美國),倒置顯微鏡(Carl Zeiss AG公司,德國),Enspire 2300多功能酶標儀(珀金埃爾默股份有限公司,美國),流式細胞儀(BD公司,美國),激光共聚焦顯微鏡(萊卡公司,德國);DMEM高糖培養液、胰酶消化液(Hyclone公司,美國),胎牛血清、青-鏈霉素(Invitrogen公司,美國),DCFH-DA熒光探針(碧云天生物技術公司,中國),N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)(碧云天生物技術公司,中國),CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司,中國),Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司,中國)。HMX和DPT由西安近代化學研究所提供,純度為99%,用DMSO(西安試劑公司,中國)溶解至1g·L-1備用。

1.2   細胞培養

CHL購于中科院上海細胞庫,培養在完全培養液中(含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養液),在5% CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養箱中培養。選取對數生長期細胞進行試驗,支原體檢測結果為陰性。

1.3   分組與處理

HMX和DPT染毒試驗各設5個染毒劑量組和1個對照組。染毒劑量分別為31.25、62.50、125、250、500mg·L-1,對照組為完全培養液處理;染毒24h。

抗氧化劑NAC干預:用含2.5 mmol·L-1 NAC的細胞培養液孵育細胞4 h,棄去含NAC的培養液,用PBS洗細胞2次,再用120 mg·L-1 DPT染毒24 h。分別設對照組(完全培養液處理)、NAC預處理+DPT組、DPT組(120mg·L-1)。

1.4   指標與方法

1.4.1   細胞活力檢測

細胞活力檢測采用CCK-8試劑盒。將CHL按2.5×104個·mL-1、每孔200 μL接種于96孔板。HMX或DPT染毒細胞24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續孵育2 h。在450 nm處利用酶標儀檢測光密度值(D),細胞活力=D實驗組/D對照組×100%。每個劑量設5個復孔,試驗獨立重復3次。

1.4.2   細胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC/PI雙染法,將CHL以2.5×104個·mL-1、每孔500 μL接種于24孔培養板。HMX或DPT染毒細胞24 h后,收集上清液,并用不含EDTA的胰酶消化所有細胞,用預冷的PBS洗細胞2次,用binding buffer重懸細胞,加入Annexin V室溫避光孵育15 min,加入PI染料,冰上孵育5 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞凋亡率=(早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數)/細胞總數×100%。試驗獨立重復3次。

1.4.3   細胞內ROS檢測

將CHL以2.5×104個·mL-1、每孔500μL接種于24孔培養板。將HMX或DPT染毒24h后的細胞收集于離心管,將DCFH-DA探針用不含酚紅、不含胎牛血清的DMEM高糖培養液稀釋至1mmol·L-1,細胞培養箱內孵育15min,避光條件下用預冷PBS洗細胞2次,PBS重懸,采用流式細胞儀檢測熒光強度。試驗獨立重復3次。

1.4.4   NAC干預

分別檢測對照組、NAC預處理+DPT組、DPT組的細胞活力和細胞凋亡情況。

1.5   統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析,數據以x±s表示,組間均數比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。

2   結果

2.1   HMX和DPT對CHL活力的影響

細胞活力檢測結果顯示相同劑量條件下,DPT對細胞的毒性更強并且呈現一定的劑量效應關系。DPT對CHL的半數抑制濃度(half-inhibitory concentration,IC50)為119.55mg·L-1,其95%CI為(70.68,278.30)mg·L-1。當DPT濃度為125mg·L-1時,細胞活力為(57.33±2.00)%;濃度為250mg·L-1時,細胞活力下降至(17.95±2.18)%;濃度為500 mg·L-1時繼續下降不明顯。HMX沒有表現出太大的細胞毒性,500 mg·L-1濃度時,CHL細胞活力為(83.34±3.03)%,與對照組相比,差異有統計學意義(P < 0.05),其余各組差異均無統計學意義,見圖 1。

圖 1

HMX和DPT對CHL細胞活力的影響(n=3)

Figure1.

Effects of HMX and DPT on the viability of CHL (n=3)

[注] *:與對照組相比,P < 0.05,#:相同劑量的DPT與HMX比較,P < 0.05。

2.2   HMX和DPT對CHL細胞凋亡和ROS的影響

與各自對照組相比,DPT和HMX各染毒組的凋亡率均隨染毒劑量增加而逐漸升高(P < 0.05)。62.50~500 mg·L-1范圍內HMX導致的細胞凋亡率由(15.63±0.58)%緩慢升至(37.00±1.25)%,而DPT引起的細胞凋亡率從(33.75±0.57)%迅速升至(96.57± 0.53)%,在相同劑量下,DPT對CHL細胞凋亡的影響大于HMX(均P < 0.05)。見表 1。

表1

HMX和DPT對CHL細胞凋亡和ROS的影響(n=3)

Table1.

Effects of HMX and DPT on apoptosis and ROS of CHL (n=3)

細胞內ROS檢測結果顯示,HMX和DPT均能引起細胞內ROS水平升高。但HMX引起細胞內ROS變化較小,250、500 mg·L-1劑量下細胞內ROS熒光強度分別為103.96±5.59和119.61±4.42;而相同劑量的DPT組細胞內ROS熒光強度分別為238.52±7.15和451.02±13.02,約是前者的2.3倍和3.8倍(P < 0.05)。在≤ 62.50 mg·L-1劑量范圍內,HMX引起的細胞內ROS熒光強度略高于DPT(P < 0.05)。見表 1。

2.3   NAC可減弱DPT誘導的CHL凋亡

結果顯示,對照組的細胞活力和凋亡率分別為(100±0.80)%、(4.75±0.40)%;NAC預處理+DPT組、DPT組的細胞活力為(76.41±4.91)%、(48.02±2.63)%,凋亡率分別為(16.85±0.12)%、(62.67±8.49)%,與對照組相比,差異具有統計學意義(P < 0.05)。

3   討論

本研究結果顯示,HMX對CHL的毒性較DPT小。有文獻報道HMX對大鼠經口染毒的LD50大于5 000 mg·kg-1,前期研究發現DPT對大鼠經口染毒LD50約為2 802 mg·kg-1[9-10],這一結果與兩種化學品對CHL的抑制趨勢一致。進一步研究發現兩種化學品均能引起CHL凋亡,但DPT的作用能力更強。同時發現兩種化學品可使細胞內ROS水平出現不同程度的升高。但在≤ 62.50 mg·L-1劑量范圍內,兩種物質引起的細胞內ROS變化水平相近,但細胞活力表現出了差異,說明在低劑量暴露條件下,DPT引起的細胞活力抑制可能與其引起的細胞內ROS變化無關。在高于125 mg·L-1劑量時,DPT引起細胞內ROS水平快速上升,同時細胞活力大幅降低。NAC是一種常見的抗氧化劑,在本研究中利用NAC預處理CHL后,發現120 mg·L-1 DPT對細胞活力的抑制程度下降,并且DPT引起細胞凋亡的能力也下降。說明在較大劑量暴露時,細胞損傷和凋亡與DPT引起的細胞內ROS水平升高有關。

通?;瘜W品或抗腫瘤藥物通過誘導細胞凋亡達到抑制其生長的作用,凋亡與細胞活力抑制呈正相關[11]。在本研究中HMX對CHL的細胞毒性較小,500 mg·L-1劑量染毒24h后細胞活力僅被抑制16.66%,而在相同染毒條件下細胞凋亡率卻高達37.00%??梢钥闯?,HMX引起的細胞凋亡并沒有導致細胞活力發生相應的變化??赡苁且驗榈腿芙舛鹊腍MX在培養液中析出并黏附在細胞表面,影響了Annexin V與細胞膜磷脂酰絲氨酸的結合。

ROS在細胞內具有雙向作用,即正常生理水平的ROS作為細胞內氧化還原信號分子,發揮信號傳遞作用。而過量的ROS會引起細胞內生物大分子氧化修飾,影響其結構和功能,最終引起細胞損傷[14]。細胞凋亡是過量ROS引起正常細胞不良結局之一,其機制與ROS引起的以死亡分子/死亡受體、腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體等死亡受體通路激活,線粒體膜通透性增加、通透性轉運通道開放、細胞色素C和凋亡誘導因子釋放為特點的線粒體凋亡通路激活[15-17],絲裂原活化蛋白激酶超家族相關的應激活化蛋白激酶介導的凋亡通路激活[18]等諸多因素有關。DPT如何引起CHL內ROS水平升高以及通過何種機制誘導細胞凋亡,對于研究DPT職業危害特征和職業防護具有重要意義,也將是下一步的研究重點。

圖 1

HMX和DPT對CHL細胞活力的影響(n=3)

Figure 1

Effects of HMX and DPT on the viability of CHL (n=3)

[注] *:與對照組相比,P < 0.05,#:相同劑量的DPT與HMX比較,P < 0.05。
表1

HMX和DPT對CHL細胞凋亡和ROS的影響(n=3)

Table 1

Effects of HMX and DPT on apoptosis and ROS of CHL (n=3)

參考文獻

[1]

曹欣茂, 李副平.奧克托今高能炸藥及其應用[M].北京:兵器工業出版社, 1993: 4-61.

DOI: 10.3389/fmicb.2016.00085
[2]

CUTHBERT J A, D'ARCY-BURT K J, CARR S M A.HMX: acutetoxicity tests in laboratory animals[R].Frederick: U.S.Army Medical Research and Development Command, 1985.

[3]

王延琦, 嚴川信, 夏寶清, 等.車間空氣中奧克托今衛生標準研究[J].工業衛生與職業病, 2001, 27(3): 134-136.

[4]

工作場所有害因素職業接觸限值第1部分: 化學有害因素: GBZ 2.1—2019[S].北京: 中國標準出版社, 2019.

[5]

許同利.1, 3, 5, 7, 7-五硝基-1, 3, 5-三氮雜環辛烷合成方法的改進[J].含能材料, 1997, 5(4): 184-187.

[6]

呂春緒.N2O5綠色硝化研究及其新進展[J].含能材料, 2010, 18(6): 611-617.

[7]

嚴川信, 程先升, 張延巍, 等.奧克托今對作業工人周圍神經傳導速度的影響[J].工業衛生與職業病, 2003, 29(1): 4-7.

[8]

李陳.奧克托今粉塵爆炸特性及其熱分解研究[D].太原: 中北大學, 2018.

[9]

陳國元, 丁瑞卿.奧克托金的(HMX)的毒性研究[J].化工勞動保護(工業衛生與職業病分冊), 1984(1): 17.

DOI: 10.11943/j.issn.1006-9941.2016.08.009
[10]

李全良, 陳軍, 王建龍.DPT制備HMX工藝研究[J].含能材料, 2007, 15(5): 509-510.

[11]

譚亞琦, 何焱玲.細胞增殖的檢測方法[J].醫學研究雜志, 2016, 45(12): 6-8, 5.

[12]

ALTIERI DC.Survivin, cancer networks and pathway-directeddrug discovery[J].Nat Rev Cancer, 2008, 8(1): 61-70.

DOI: 10.1038/nrc2293
[13]

WILLI J, KüPFER P, EVéQUOZ D, et al.Oxidative stress damagesrRNA inside the ribosome and differentially affects the catalytic center [J].Nucleic Acids Res, 2018, 46(4): 1945-1957.

DOI: 10.1093/nar/gkx1308
[14]

RUIZ-RAMOS R, LOPEZ-CARRILLO L, RIOS-PEREZ A D, et al.Sodium arsenite induces ROS generation, DNA oxidative damage, HO-1 and c-Myc proteins, NF-κB activation and cell proliferation in human breast cancer MCF-7 cells[J].Mutat Res, 2009, 674(1/2): 109-115.

DOI: 10.1016/j.mrgentox.2008.09.021
[15]

CIRCU M L, AW T Y.Reactive oxygen species, cellular redoxsystems, and apoptosis[J].Free Radic Biol Med, 2010, 48(6): 749-762.

DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2009.12.022
[16]

MARTIN K R, BARRETT J C.Reactive oxygen species asdouble-edged swords in cellular processes: low-dose cell signaling versus high-dose toxicity[J].Hum Exp Toxicol, 2002, 21(2): 71-75.

DOI: 10.1191/0960327102ht213oa
[17]

SIMON H U, HAJ-YEHIA A, LEVI-SCHAFFER F.Role of reactive oxygen species(ROS) in apoptosis induction[J].Apoptosis, 2000, 5(5): 415-418.

DOI: 10.1023/A:1009616228304
[18]

WADA T, PENNINGER J M.Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation[J].Oncogene, 2004, 23(16): 2838-2849.

DOI: 10.1038/sj.onc.1207556
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[作者簡介]

[收稿日期] 2020-03-02

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